Métodos de estudo da célula

As organelas e as macromoléculas podem ser separadas por ultracentrifugação

A esse fracionamento celular tornou-se possível somente após o desenvolvimento comercial, no início da década de 1940, de um istrumento chamado de ultracentrífuga preparativa, na qual os extratos de células rompidas são girados em altas velocidades separando, assim, os componentes por tamanha e densidade. As unidades maiores experimentam a força centrífuga mais forte e se movem mais rapidamente. Em uma velocidade relativamente baixa, os componentes grandes, como núcleos, formam um sedimento no fundo do tudo de centrífuga; em uma velocidade levemente mais alta, é depositado um sedimento de mitocôndrias;e a velocidade ainda mais alta, e com um período de centrifugação mais longo, primeiro as vesículas pequenas fechadas e, depois os ribossomos, podem ser coletados. Todas essas frações são impuras, mas vários dos contaminantes podem ser removidos ressuspendendo o sedimento e repetindo o procedimento de centrifugação várias vezes.
A centrifugação é o primeiro passo na maioria dos fracionamentos, mas ela só separa componentes q são muito diferentes nos tamanho. Um grau de mais detalhamento na separação pode ser alcançado colocando-se o homogenato, de maneira que forme uma fina camada, no topo de uma solução salina diluída dentro de um tubo de centrífuga. Isso faz que, quando centrifugados , os vários componentes na mistura movam-se como uma série de bandas distintas pela solução salina, cada uma com uma velocidade diferente, em um processo chamado sedimentação por velocidade. Para que o procedimento funcione bem, ax bandas devem ser protegidas de ser misturadas por convecção, o que ocorreria normalmente quando uma solução mais densa é colocada no topo de uma solução menos densa. Isto é alcançado preenchendo o tubo de centrifugação com um gradiente de sacarose preparado por um misturador especial. O gradiente de densidade resultante – com a parte mais densa no fundo do tubo – mantém cada região da solução salina mais densa do que qualquer solução acima dela, evitando que uma mistura por convecção distorça a separação.
Quando sedimentos por meio de tais gradientes diluídos de sacarose, os diferentes componentes celulares separam-se em bandas distintas que podem ser coletadas individualmente. As centrífugas atuais rodam a velocidade de até 80.000 rpm e reduzem forças tão altas quanto 500 mil vezes mais do que a gravidade. Com essa enorme força, até mesmo moléculas pequenas, como as do tRNA e as simples enzimas, podem ser forçadas a sedimentar a uma velocidade apreciável e, assim, ser separadas uma das outras pelo tamanho.
A ultracentrífuga também é utilizada para separar componentes celulares de acordo com sua densidade de flutuação, independentemente do seu tamanho e da forma. Nesse caso, a amostra é usualmente sedimentada por um gradiente de densidade que contém uma alta concentração de sacarose ou de cloreto de césio. Cada componente celular começa a descer pelo gradiente, mas, eventualmente, alcança uma posição em que a densidade da solução é igual a sua própria densidade. Nesse ponto, o componente flutua e não pode mais se mover. Uma série de bandas distintas é então produzida no tubo de centrífuga, com bandas mais próximas do fundo do tubo contendo componentes de maior densidade de flutuação. Esse método é chamado de sedimentação por equilíbrio, e é tão sensível que é capaz de separar macromoléculas incorporadas a isótopos pesados. De fato o método cloreto de césio foi desenvolvido, em 1957, para separar o DNA marcado do não marcado, após a exposição de uma população de bactérias em crescimento a nucleotídeos precursores contendo 15N; este experimento clássico proporcionou a evidência direta pra a replicação semiconservativa do DNA.

As células podem crescer em uma placa de cultura.

Dadas as condições apropriadas, a maioria da das células vegetais e animais podem viver, multiplicar e mesmo expressar propriedades diferentes em uma placa de cultura de tecidos. As células pode ser observadas continuamente ao microscópio ou analisadas bioquimicamente, e os efeitos de adicionar ou remover moléculas especificas, como hormônio ou fatores de crescimento, podem ser explorados. Alem disso, misturando dois tipos de células, as interações entre células e outro podem ser estudadas. Os experimentos realizados com células em cultura são às vezes conduzidos in vitro para compará-los com aquele que utilizam organismos intactos – conduzidos in vitro esses termos podem ser confusos, porque são frequentemente utilizados em sentidos muito diferentes pelo bioquímico. Em laboratório de bioquímica, in vitro se refere a reações que ocorrem em um tubo de ensaio na ausência de células vivas, enquanto que o in vitro se refere se refere a qualquer reação que ocorra dentro de uma célula viva.
A cultura de tecidos começou, em 1907, com um experimento para resolver uma controvérsia neurológica. Atualmente, as culturas são mais comumente feitas de suspensão de células dissociadas a partir de tecidos, utilizando os métodos descritos anteriormente. A maioria das células de tecido, não está adaptada para viver em suspensão e requer uma superfície sólida para crescer e se dividir. O suporte geralmente usado para cultura de células é a superfície de uma placa de plástico para cultura de tecidos. As células têm necessidades variadas, e muitas delas não crescem ou se diferenciam, a não ser que a placa de cultura seja coberta com componentes específicos da matriz extracelular, como colágeno ou laminina.
As culturas preparadas diretamente dos tecidos de um organismo, ou seja, sem proliferação celular in vitro são chamadas de culturas primárias. Elas podem ser feitas com ou sem uma etapa inicial de fracionamento para separar diferentes tipos de células. Na maioria dos casos, as células em cultura primária podem ser removidas da placa de cultura e proliferadas para formar um grande número das, assim chamadas, culturas secundarias; dessa maneira elas podem ser subcultivadas repetidamente durante semanas ou meses.